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            親和層析法純化抗體常見問題
            如何對血清、腹水、培養物上清液等來源的抗體樣品進行預處理?
            最常用的預處理方法是沉淀法。對于腹水中的脂蛋白,常用硫酸右旋葡糖酐沉淀,或是在pH=7時,采用PVP沉淀b-脂蛋白和球蛋白。上樣時若腹水樣品太粘稠可以使用上樣緩沖液稀釋樣品。對于白蛋白等雜蛋白,可以使用分級沉淀法去除,如硫酸銨沉淀、羊脂酸沉淀等。利用脫鹽柱或透析可以除去鹽離子并更換緩沖液。
            純化不與Protein A或G結合的IgM、IgY該怎么選擇填料?
            (1)通常采用沉淀法結合凝膠過濾法純化IgM,但對于大量純化抗體,這種方案繁瑣且產量低。
            (2)采用Protein L親和填料,特異性的結合κ輕鏈,對純化抗體片段及完整地抗體IgG、IgM和IgA很有用。
            (3)嗜硫填料是根據其配基與抗體間的二硫鍵產生特異性相互作用,中性條件下吸附、洗脫,純化后蛋白活性高,是一種通用型抗體純化手段。
            怎么純化抗體Fab 片段?
            (1)Protein L可以特異性的結合抗體的κ輕鏈,因此,只要Fab 片段中含有κ輕鏈,就可以選擇Protein L填料進行純化。
            (2)Protein G 除了可以特異性結合IgG 的Fc 片段,還可以特異性低親和的與某些抗體Fab片段結合。
            (3)Protein A只結合IgG的Fc片段。采用流穿模式,將純的IgG酶解后過Protein A填料,Fab在流穿峰,Fc片段結合在填料上。
            如何提高抗體回收率?
            (1)更換親和力更高的填料。
            (2)對于Protein A填料,結合pH可以升至8-9。
            (3)填料多次使用后殘留物增多,載量降低,建議用6M鹽酸胍或70%乙醇清洗填料。對于耐堿填料可以使用0.1-0.5M NaOH清洗。
            為什么洗脫液中沒有正確條帶?
            (1)首先看樣品是否結合,抗體種屬亞型與親和填料是否有親和力,結合緩沖液pH是否中性,流穿中抗體是否有減少,可將原始樣品和流穿同時跑SDS-PAGE電泳進行分析。
            (2)再看樣品是否與填料結合太牢固,沒有洗脫下來,建議用pH更低的緩沖液洗脫。
            (3)洗脫后酸性條件下抗體是否水解,可在收集管中預先加入中和液或精氨酸等保護劑,或者選擇能在近中性條件下洗脫的填料。
            洗脫后抗體純度不高怎么辦?
            (1)洗雜是否完全?可取最后洗雜液跑SDS-PAGE電泳進行分析。
            (2)適當提高結合時鹽離子濃度,或在洗雜液中加入低濃度的非離子型去垢劑,降低非特異性吸附。
            (3)上樣前樣品預處理,除去部分雜質。
            (4)采用兩步純化,先親和層析純化,后經離子交換層析,除去HCP 、脫落的 Protein A以及部分聚體等等,得到純度更高的抗體。
            體外培養表達IgG,如何避免培養基中如小牛血清IgG干擾?
            (1)血清可先用Protein G預處理,在培養前除去IgG;蜻x用IgG含量較低的血清。
            (2)樣品先用Protein A或G純化,得到的抗體再經過疏水層析除去牛IgG。
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